Badania pojedynczych nanokryształów

Zastosowanie nanokryształów konwertujacych energię w górę (UCNPs) jako donorów energii dla molekuł akceptora wiąże się z pewnymi komplikacjami. Jony donora charakteryzują się długimi czasami życia poziomów wzbudzonych (rzędu setek mikrosekund) i występują w liczbie znacznie przewyższającej liczbę cząsteczek barwnika (akceptora). Dla porównania, czasy życia poziomów wzbudzonych cząsteczek barwników organicznych wynoszą zaledwie kilka nanosekund. Prowadzi to do nowej sytuacji, w której wiele donorów może oddziaływać z pojedynczym akceptorem. W konsekwencji pojedyncza cząsteczka barwnika zakotwiczona na powierzchni nanocząstki może zostać ponownie „naładowana” energią po emisji fotonu.

Nasze prace nad FRET opartym na konwersji energii w górę obejmowały dotychczas pomiary próbek koloidalnych, co skutkowało uśrednionym odczytem wielu parametrów FRET, takich jak redukcja intensywności emisji donora, czy skrócenie czasu zaniku jego poziomów wzbudzonych w obecności akceptora. Podejście to opiera się na założeniu, że badane próbki są identyczne pod względem stężenia, zarówno UCNPs, jak i cząsteczek barwnika. Obecnie rozwijamy te badania, analizując koniugaty pojedynczych UCNPs z cząsteczkami barwnika oraz ilościowo porównując ich przydatność w biosensorach FRET opartych na konwersji energii w górę. W tym celu zaprojektowaliśmy i zbudowaliśmy nowy układ optyczny umożliwiający ocenę i porównanie widm emisji oraz czasów zaniku luminescencji pojedynczych nanokryształów bez oraz w obecności akceptora. Układ ten został przedstawiony na rysunku 1.

Rysunek 1. Schemat układu pomiarowego. S - próbka, LP – filtr dichroiczny longpass (@950nm). DMSPi – zwierciadło dichroiczne, shortpass, z krawędzią trasmisji przy λ nm; DMLPi oraz BPi – zwierciadła dichroiczne longpass  (LP) oraz bandpass (BP), które definiują przedziały spektralne w których intensywność emisji jest rejestrowana za pomocą kolejnych diod lawinowych (APDi); diody lawinujące generują pojedyncze impulsy LVTTL proporcjonalne do strumienia fotonów (do 1 MHz), które są zliczane przez 8-kanałowy licznik fotonów w celu bardziej zaawansowanej analizy.

Zbieranie fotonów emitowanych z obszaru ograniczonego plamką o rozmiarze dyfrakcyjnym pozwala analizować jedną UCNP naraz. Wykorzystujemy jedne z najczulszych dostępnych detektorów – fotodiody lawinowe – które zapewniają wiarygodny odczyt. Umożliwia to ilościową ocenę różnie zaprojektowanych architektur UCNPs dla zastosowań FRET na poziomie pojedynczej nanocząstki. Dzięki temu nie ma już potrzeby zakładania, że wszystkie próbki mają identyczne stężenia, co znacząco upraszcza analizę ilościową.

Wybór czterech zestawów filtrów – zwierciadeł dichroicznych longpass (DMLPi) oraz filtrów pasmowych bandpass (BPi) – zależy od rodzaju jonów aktywatora w UCNPs oraz barwników zakotwiczonych na powierzchni nanokryształu. Odpowiednio dobrany zestaw filtrów pozwala rozróżniać różne cząsteczki barwników (pod warunkiem, że ich maksima emisji są rozdzielone spektralnie) na poziomie pojedynczej UCNP.

Podczas skanowania próbki za pomocą lasera jego plamka jest przemieszczana po próbce w procesie zwanym skanowaniem rastrowym. Otrzymujemy mapę pikseli, z których każdy reprezentuje intensywność emisji generowanej przez dany punkt ograniczony dyfrakcją. Niestety średnica wiązki wynosi około 500 nm, podczas gdy rozmiar UCNP mieści się w zakresie 10–50 nm. Oznacza to, że nie możemy rozdzielić przestrzennie dwóch lub więcej UCNP, jeśli są oddalone od siebie o mniej niż ~300 nm. Prowadzi to do sytuacji przedstawionej na Rysunku 2.

Rysunek 2. Obraz UCNPs uzyskany za pomocą skanowania rastrowego. Strzałki wskazują miejsce „powiększenia” obrazu i wykonania przekroju intensywności. Umożliwia to określenie wartości I_single, odpowiadającej pojedynczemu emiterowi – jednej UCNP. Dwie, trzy lub więcej UCNPs znajdujących się w obszarze wiązki daje wartości będące całkowitą wielokrotnością tej wartości, I_single × N. W tym przypadku I_single ~ 60, a I_double ~ 120.

Po ustabilizowaniu wiązki laserowej w każdym punkcie możemy zbierać widma i przeprowadzać pomiary czasowo-rozdzielcze w celu oszacowania czasu życia poziomów wzbudzonych nanokryształów.

Ostatecznie wykorzystaliśmy układ do pomiaru próbek – dobrze zdyspergowanych UCNPs do których powierzchni został przyłączony barwnik ATTO550 w niskim stężeniu. Spodziewaliśmy się, że rozkład cząsteczek barwnika nie będzie jednorodny i nie każda UCNP będzie zawierała cząsteczki barwnika na swojej powierzchni. Wykorzystaliśmy dwa kanały (dwa APD i dwa zestawy filtrów), w których pierwszy służył do zbierania intensywności emisji UCNP (donora), a drugi do rejestracji emisji barwnika (akceptora). Uzyskany obraz przedstawiono na Rysunku 3.

Rysunek 3. Obraz UCNPs sprzężonych z barwnikiem uzyskany za pomocą skanowania rastrowego. Agregacja jest ograniczona, większość UCNPs jest rozproszona, co umożliwia pomiary pojedynczych nanokryształów. Możliwe jest rozróżnienie wysokich (czerwone) i niskich (żółte) wartości intensywności emisji barwnika.

Obecnie testujemy układ i optymalizujemy go pod kątem finalnej detekcji w czterech kanałach.

Autor: Stanisław Okwiet