Försterowski Rezonansowy Transfer Energii

Försterowski rezonansowy transfer energii (ang. Förster resonant energy trasnfer, FRET) to zjawisko transferu energii oparte na sprzężeniu momentów dipolowych dwóch fluorescencyjnych indywiduów chemicznych, które znalazło szerokie zastosowanie do badania interakcji pomiędzy nimi tj. pomiędzy donorem (D) oraz akceptorem (A). Energia zaabsorbowana przez molekuły donora może zostać przekazana niepromieniście do molekuł akceptora po spełnieniu trzech podstawowych warunków:

Widmo emisji D pokrywa się z widem absorpcji A.
Donor i akceptor znajdują się w bliskiej odległości (zazwyczaj <10 nm).
Molekuły donora oraz akceptora są odpowiednio ułożone w przestrzeni.

Zjawisko to, określane niekiedy jako „linijka spectroskopowa”, stanowi podstawę projektowania licznych biosensorów służących do badania np. konformacji białek, aktywności enzymów, hybrydyzacji DNA czy reakcji antygen–przeciwciało. Metody te mogą być wykorzystywane zarówno w diagnostyce medycznej, jak i w badaniach podstawowych w celu zrozumienia procesów zachodzących w żywych komórkach.

Chociaż do detekcji FRET powszechnie stosuje się fluorofory organiczne (barwniki, białka fluorescencyjne itp.) jako D lub A, takie znaczniki mają liczne ograniczenia, m.in.: fotowybielanie D i A, nakładanie się widm emisji lub wzbudzenia molekuł D/A utrudniające detekcję (nakładanie się widm emisji) lub prowadzjące do bezpośredniego wzbudzenia akceptora promieniowaniem wzbudzajacym (nakładanie się widm wzbudzenia), niski stosunek sygnału do tła (spowodowany wysoką energią promieniowania wzbudzającego, co może skutkować wzbudzeniem innych biomolekuł obecnych w próbce), czy krótkie czasy życia poziomów wzbudzonych barwników organicznych.

Rys. 1. Nakładaniae się widma emisji donora z widmem absorpcji akceptora.

Rys. 2. Mechanizm FRET

Nanokryształy konwertujące energię w górę (ang. upconverting nanopartciles, UCNPs) pozwalają obejść wiele z tych ograniczeń, wprowadzając jednak nowe wyzwania, takie jak: detekcja wielu D (w jednym nanokrysztale znajdują się setki, lub nawet tysiące jonów donora) i wielu A jednocześnie ), długie czasy narastania fotoluminescencji D oraz ciągłą repopulację poziomów wzbudzonych jonów D w procesie konwersji energii w górę. Naszym celem jest badanie, zrozumienie i zastosowanie takich nowych materiałów i metod detekcji biologicznej opartych na UCNPs.

Wydajność zjawiska FRET można zostać obliczona na podstawie poniższego równania:

Gdzie Ι_D i Ι_DA to zcałkowana intensywność emisji donora, bez akceptora i w jego obecności odpowiednio. Podobnie τ_D i τ_DA to czasy życia poziomu wzbudzonego donora, bez akceptora i w jego obecności.

Ze względu na odwrotną zależność od szóstej potęgi odległości, zwiększenie dystansu między donorem a akceptorem może prowadzić do obniżenia wydajności FRET. Aby zmierzyć tę wartość eksperymentalnie, można określić czas życia poziomów wzbudzonych donora, spadek intensywności luminescencji donora lub fluorescencję akceptora (jeżeli akceptor jest fluorescencyjny).

Nasze badania koncentrują się na wykorzystaniu nanokryształów domieszkowanych jonami lantanowców, a w szczególności nanokryształów konwertujących energię w górę jako donorów energii w sensorach opartych na FRET. Mają one średnicę rzędu kilkudziesięciu nanometrów. Wykazują wyjątkową zdolność do generowania widzialnej lub daleko-czerwonej luminescencji pod wzbudzeniem w podczerwieni (NIR), co daje im unikalne zalety jako donory FRET. Przykładem takich związków jest NaYF₄:Yb³⁺, Er³⁺.

Pierwszą ich zaletą jest wysoka fotostabilność, wynikająca z obecności jonów Ln³⁺, ponieważ elektrony powłoki 4f są osłonięte przez powłoki 5s i 5p przed wpływem środowiska chemicznego. Kolejne korzyści to wąskie pasma emisji oraz długie czasy zaniku luminescencji. Długi czas życia luminescencji wynika z faktu, że przejścia wewnątrz powłoki f są zabronione przez regułę Laporte’a. UCNPs mogą emitować światło ultrafioletowe, widzialne lub bliskiej podczerwieni po absorpcji światła NIR.

Projektujemy i badanmy również wirtualne modele nanokryształów (VNP). Nanokryształy typu rdzeń-płaszcz mają wewnętrzny rdzeń oraz zewnętrzny płaszcz domieszkowany w różny sposób, celem zwiększenia wydajności FRET. Nasze badania pozwalają zrozumieć rolę transferu energii i migracji energii między jonami lantanowców oraz wpływ architektury UCNP typu rdzeń-płaszcz na ich wydajność jako donorów FRET dla organicznych barwników. Strukturę i diagram energetyczny syntezowanych nanocząstek rdzeń- płaszcz przedstawiono na poniższym rysunku (Rys. 3) ^[1].

Rys. 3. Właściwości strukturalne zsyntezowanych nanomateriałów o architekturze rdzeń-płaszcz różniące się umiejscowieniem jonów lantawnoców wraz z diagramami energetycznymi. Obrazy a) TEM, b) TEM-EDS, c) TEM, d) dystrybucja rozmiaru nanokryształów o architekturze NaYF4:Yb@NaYF4:Er. Schemat zsyntezowanych UCNPs: e) niedomieszkowany rdzeń - aktywny płaszcz (NaYF₄@NaYF₄:2%Er), f) uczulający rdzeń - aktywny płaszcz (NaYF₄:20%Yb@NaYF₄:2%Er), g) uczulający rdzeń - aktywny płaszcz (NaYF₄:20%Yb@NaYF₄:20%Yb, x%Er, gdzie x = 0.1, 0.2, 0.5, 2, 3, 4, and 5%); h) diagram energetyczny konwersji energii w górę pomiędzy jonami Yb^₃₊-Er^₃₊ oraz bezpormienistego transferu energii z jonów Er³⁺ do przyłączonych do powierzchni molekuł barwnika - różu bengalskiego.

Odkryliśmy interesujące zależności, które potwierdzają, że UCNPs o architekturze rdzeń-płaszcz, w której jony donorów umieszczone są w płaszczu są korzystne celem osiągnięcia wysokiej czułości FRET w porównaniu do konwencjonalnych UCNP, w których jony donorów są równomiernie rozmieszczone w całej objętości. Ponadto wykazaliśmy, że różne drogi wzbudzenia mogą odgrywać rolę pasożytniczą w detekcji FRET opartej na czasie zaniku luminescencji. Energia zaabsorbowana przez jony Yb³⁺ i przekazywana do jonów Er³⁺ może ciągle repopulować poziomy wzbudzone jonów Er³⁺ skutkując mniejszą podatnością czasów zaniku luminescencji jonów donora w detekcji FRET.^[2]

Dodatkowo badaliśmy FRET między nanokryształami konwertującymi energię w górę jako donorami a kropkami kwantowymi jako akceptorami. Wykazaliśmy, że ten układ posiada kluczowe cechy niezbędne do zastosowań FRET. Należą do nich duża nakładania widm emisji donora i absorpcji akceptora oraz zadowalająca wydajność kwantowa donora. Zarówno emisja akceptora, jak i spadek czasu życia luminescencji donora zostały potwierdzone eksperymentalnie i były w dobrej zgodności z teoretyczną wartością odległości Förstera.^[3]

Autorzy: Julia Wnętrzak, Agata Kotulska & Artur Bednarkiewicz

Literatura:

[1] A. Pilch-Wróbel, A. M. Kotulska, S. Lahtinen, T. Soukka, A. Bednarkiewicz, Engineering the compositional architecture of core‐shell upconverting lanthanide‐doped nanoparticles for optimal luminescent donor in resonance energy transfer: the effects of energy migration and storage, Small 18.18 (2022): 2200464

[2] A. M. Kotulska, A. Pilch-Wróbel, S. Lahtinen, T. Soukka, A. Bednarkiewicz, Upconversion FRET quantitation: the role of donor photoexcitation mode and compositional architecture on the decay and intensity based responses, Light: Science & Applications 11.1 (2022): 256

[3] A. Bednarkiewicz, M. Nyk, M. Samoc, W. Strek, Up-conversion FRET from Er³⁺/Yb³⁺:NaYF₄ Nanophosphor to CdSe Quantum Dots, Journal of Phyical Chemistry C, 114.41 (2010): 17535-17541