Termometria luminescencyjna

Mapowanie rozkładu temperatury (skanowanie rastrowe) jest zwykle realizowane za pomocą chłodzonych kamer półprzewodnikowych o wąskiej przerwie energetycznej (np. InAt, InAs, HgCdTe, PbS, PbSe) lub kamer mikrobolometrycznych (np. amorficzny Si lub tlenek wanadu) – czyli matryc pikseli czułych na bliską podczerwień (NIR). Takie kamery pracują w zakresie spektralnym około 3–14 μm i mierzą intensywność, która jest bezpośrednio związana z emisją ciała doskonale czarnego. Zarówno detektor, jak i odpowiednie elementy optyczne (np. kryształy germanowe lub szafirowe) sprawiają, że system jest relatywnie drogi, a ze względu na pracę w zakresie NIR nie jest łatwo adaptowalny do obrazowania o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, co czyni go w praktyce nieodpowiednim do mikroskopowego obrazowania biologicznego.

Rozwiązaniem tego problemu jest zastosowanie fotoluminescencyjnych materiałów zależnych od temperatury (TPM), np. polimerów, białek, kropek kwantowych, kompleksów czy luminoforów, których właściwości spektralne (intensywność luminescencji lub czas życia, stosunek pasm, przesunięcia spektralne itp.) są proporcjonalne do lokalnej temperatury. Choć konieczność wprowadzenia egzogennych cząstek luminescencyjnych może być w pewnym stopniu inwazyjna dla komórek lub tkanek, bioobrazowanie z wykorzystaniem nanomateriałów okazało się być zarówno skutczne, jak i relatywnie bezpieczne.

Chociaż obrazowanie temperatury – w odróżnieniu od prostszych pomiarów punktowych – było realizowane z użyciem różnych cząsteczek wrażliwych na temperaturę, raporty dotyczące obrazowania z wykorzystaniem luminoforów domieszkowanych lantanowcami lub metalami są nieliczne. Wiele badań wykazało obiecujące właściwości w pomiarach punktowych, jednak ze względu na fotofizykę tych termometrów optycznych trudno je zastosować w szybkim trybie obrazowania w szerokim polu (tj. nie rastrowym). Problemy wynikają z kilku faktów: pasma emisji wykorzystane do analizy ratiometrycznej nakładają się na siebie, przesunięcia spektralne lub zmiany czasu zaniku luminescencji są zbyt małe w odpowiedzi na zmiany temperatury, a sondy są zbyt słabe do równoczesnej detekcji na dużym obszarze.

Wykorzystanie luminescencyjnych nanokryształów stanowi obiecującą alternatywę dla organicznych TPM, ponieważ wykazują one doskonałą fotostabilność, wąskopasmową absorpcję i emisję anty-stokesowką oraz długie czasy życia poziomów wzbudzonych – cechy pożądane w ultraczułym bioobrazowaniu i biodetekcji.

Niestety, intensywność ich luminescencji jest stosunkowo niska, czułość temperaturowa zwykle nie przekracza 2%/K, a odczyt temperatury jest technicznie trudny ze względu na blisko położone i nakładające się pasma spektralne, używane do określenia parametru luminescencyjnego zależnego od temperatury (TLP). Takie podejście wymaga zazwyczaj wysokorozdzielczych widm emisji, aby po odpowiedniej kalibracji można było wiarygodnie przeliczyć TLP na jednostki temperatury. Choć podejmowano próby wykorzystania stosunku intensywności emisji różnych, spektralnie odmiennych multipletów, co upraszcza określenie TLP w 2D, ich czułość temperaturowa lub jasność nadal nie były zadowalające. W połączeniu z koniecznością uzyskania widm wysokiej rozdzielczości, mapowanie temperatury w 2D staje się uciążliwe, ponieważ ani filtry pasmowe z czułymi kamerami, ani 32-kanałowe detektory PMT w trybie skanowania rastrowego nie zapewniają wystarczającej rozdzielczości spektralnej do wiarygodnego pomiaru temperatury.

Ponadto, stosowanie mało wydajnych i wąskopasmowych luminoforów domieszkowanych lantanowcami wymaga użycia laserów wzbudzających o wysokiej gęstości mocy, które są nie tylko kosztowne, ale mogą też niepożądanie przegrzewać próbkę lub zakłócać dokładny pomiar temperatury. Tworzenie dużego, jednorodnego obszaru wiązki (np. bez efektu speckli, z profilem top-hat) w polu widzenia mikroskopu jest kolejnym wyzwaniem dla obrazowania 2D.

Chociaż problemy z jednorodnością wiązki nie dotyczą obrazowania rastrowego, koszt lasera, długie czasy zaniku luminescencji powodujące „przenikanie” sygnału do sąsiednich pikseli, często zbyt niska rozdzielczość spektralna (co przekłada się na niewystarczającą czułość temperaturową) oraz długi czas rejestracji obrazu czynią obrazowanie temperatury w szerokim polu za pomocą z luminoforów (ang. whole-field phosphor-assisted temperature imaging, PATI) poważnym wyzwaniem.

Nowym podejściem do wizualizacji temperatury w koncepcji PATI jest wykorzystanie stosunku intensywności wzbudzenia rezonansowego do nierezonansowego (RNR-EIR), gdzie obserwuje się pojedyncze pasmo emisji pod dwoma spektralnie odmiennymi długościami fali wzbudzenia – rezonansową i nierezonansową. Podejście to spełnia wszystkie wymagania dla praktycznego zastosowania jonów metali luminescencyjnych (RE lub TM) do czułego mapowania temperatury w szerokim polu. Dotyczy to zarówno właściwości materiałów (wysoka fotostabilność, wysoka jasność, czułość temperaturowa w zakresie fizjologicznym), jak i prostoty technicznej odczytu.

Ogromną zaletą proponowanego podejścia jest możliwość wykorzystania konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego (np. lampa halogenowa) do wzbudzenia oraz standardowej kamery CMOS-Vis do rejestracji spektralnie zintegrowanych obrazów w pojedynczym paśmie emisji przy dwóch różnych pasmach wzbudzenia (realizowanych za pomocą kostek filtrów). Nowa metoda wykorzystuje intensywności w tym samym paśmie emisji, przy dwóch, rezonansowym i nierezonansowym, pasmach wzbudzenia. Stosunek dwóch uzyskanych obrazów wykazuje zależność proporcjonalną do temperatury.

Jest to zasadniczo odmienne od konwencjonalnej metody stosunku intensywności luminescencji (LIR) i stanowi wyzwanie dla istniejących technik mapowania temperatury z użyciem luminoforów, oferując wyższą jasność luminoforów (konwencjonalna lampa halogenowa mikroskopu wystarczała jako źródło wzbudzenia) oraz, przede wszystkim, prostotę techniczną mapowania temperatury 2D w trybie całopolowym z rozdzielczością optyczną rzędu mikrometrów.

Zbadano trzy różne materiały, mianowicie nanokryształy YAP, YAG i LiLaP₄O₁₂ domieszkowane jonami Cr³⁺, do zastosowań w luminescencyjnej termometrii opartej na RNR-EIR, wykorzystując pojedyncze pasmo emisji przy wzbudzeniu rezonansowym i nierezonansowym. Wykorzystano fakt, że wyższa temperatura ułatwia absorpcję z wyżej położonych podpoziomów wibracyjnych stanu podstawowego ⁴A₂, dzięki czemu luminescencja nierezonansowa może być promowana w wyższych temperaturach. Z drugiej strony temperatura wpływa na intensywność emisji zarówno przy wzbudzeniu rezonansowym, jak i nierezonansowym. Dlatego oczekiwano istotnej różnicy między wygaszaniem termicznym luminescencji Cr³⁺ przy 482 nm pod wzbudzeniem rezonansowym i nierezonansowym; pasmo 482 nm wykorzystano jako parametr zależny od temperatury w bezkontaktowym pomiarze temperatury.

Najwyższą czułość stwierdzono dla nanokryształów YAP – 0,25%/K w zakresie temperatur fizjologicznych i do 0,37%/K przy −150 °C. Wysoka zdolność nanokryształów YAP do detekcji temperatury wynika z silnego pola krystalicznego matrycy. Uzyskane wyniki potwierdzają wysoki potencjał aplikacyjny prezentowanej techniki do bezkontaktowego pomiaru temperatury i mogą stanowić szybką oraz przystępną alternatywę dla luminescencyjnej termometrii 2D opartej na względnych zmianach intensywności emisji.

Dodatkowo przeprowadzony eksperyment z wykorzystaniem luminescencyjnego termometru RNR-EIR wykazał nie tylko wyższą rozdzielczość proponowanej techniki w porównaniu do kamer termowizyjnych, ale także możliwość adaptacji do mikroskopów fluorescencyjnych, co ma duże znaczenie dla badań biologicznych. Ze względu na jasność luminoforów, konwencjonalna lampa halogenowa została użyta jako źródło wzbudzenia z dwoma kostkami filtrów i jedną czułą kamerą widzialną. W związku z tym proponowane materiały i metoda zapewniają znacznie wyższe tempo odpowiedzi oraz stwarzają perspektywy do określania temperatury szybko poruszających się lub obracających elementów mechanicznych.

Wyniki zostały opublikowane w pracy:

A. Bednarkiewicz, K, Trejgis, J. Drabik, A. Kowalczyk, L. Marciniak, Phosphor Assisted Temperature Sensing and Imaging using resonant and non-resonant photoexcitation scheme, ACS applied materials & interfaces 9.49 (2017): 43081-43089.