Nowe anty-Stokesowskie znaczniki luminescencyjne i wielokolorowy FRET do sekwencjonowania pojedynczych nici DNA (LantaSEQ)  

Kierownik projektu: prof. dr hab. Artur Bednarkiewicz 
Kierownik zagraniczny: Assoc. Prof. Hans Gorris Ph.D

Sekwencjonowanie pojedynczych molekuł DNA jest bardzo pożądane w diagnostyce molekularnej ze względu na:

• uproszczone przygotowanie matrycy DNA,
• większą przepustowość i szybkość,
• dłuższe odczyty, co prowadzi do zmniejszenia kosztów w porównaniu z konwencjonalnymi technikami sekwencjonowania.

Jednak obecne techniki sekwencjonowania pojedynczych molekuł DNA mają kilka wad, które można przezwyciężyć, wykorzystując unikalne cechy fotofizyczne nowych luminescencyjnych nanomateriałów domieszkowanych lantanowcami (LnNP):

• LnNP wydajnie emitują światło widzialne pod wpływem wzbudzenia NIR z dużymi przesunięciami antystokesowskimi >300 nm. W takich warunkach żadne inne składniki próbki nie są wzbudzane, a sygnał tła spowodowany autofluorescencją i rozpraszaniem światła jest eliminowany.
• LnNP są fotostabilne i, w przeciwieństwie do kropek kwantowych, nie wykazują migotania. W konsekwencji nowe nanocząstki zapewniają stabilny sygnał donora dla FRET, który jest niezbędny do ciągłego odczytu długich sekwencji DNA.
• LnNP emitują wiele wąskich pasm emisyjnych pod wpływem wzbudzenia pojedynczą długością fali, tak że pojedyncza nanocząstka luminescencyjna może być użyta jako donor FRET do czterech różnych barwników akceptorowych, które są wymagane do identyfikacji poszczególnych dNTP.

Sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem nanocząstek domieszkowanych lantanowcami to obiecujące podejście, jednak nigdy wcześniej nie zostało zrealizowane. Aby to osiągnąć, konieczne jest:

• optymalizacja przyrządów do odczytu optycznego w celu wykrywania pojedynczych LnNP i obrazowania mikroskopowego w szerokim polu.
• zsyntetyzowanie i badanie nowych specjalnie zaprojektowanych LnNP poprzez optymalizację architektury domieszkowania i składu rdzeń-powłoka, aby uczynić je jak najjaśniejszymi i najbardziej wrażliwymi na cząsteczki akceptorowe.
• zoptymalizowanie koniugacji powierzchniowej polimerazy, aby zminimalizować odległość między UCNP a polimerazą.
  - wykorzystanie nowoopracowanych materiałów, przyrządów i metod do sekwencjonowania testowych molekuł DNA